如何养好细胞：细胞培养全流程与常见问题详细笔记

如何养好细胞：细胞培养全流程与常见问题详细笔记

细胞培养是生物实验的基础，养好细胞的关键在于理解培养体系演进、按“准备—生长—冻存—分析”全流程规范操作，并对培养基、血清、换液、传代消化和形态异常等常见问题及时排查。

一、讲座背景与主办方介绍

本次讲座主题是“如何养好我们的细胞”。细胞培养是生物实验的基础，想养好细胞需要关注很多细节。课程目标是了解细胞培养全流程以及常见问题。

主讲方为上海优牛维生物科技股份有限公司。原文介绍：

• 优牛维自 2004 年成立以来，一直专注于抗体和相关产品，是国内专业全面的抗体供应商和抗体专家。
• 十多年来努力发展成为生命科学一站式供应商，可提供全面产品、专业技术服务，以及智能供应链服务，包括定制研发服务、实验服务、采购平台服务。
• 六大子品牌包括爱必信、诺贝时、优I斯达特、优弗、瑞宝平台等；后文还提到南京优爱、斯加特、优普等。
• 优尼维集团同时运营几大品牌：
• 有“国产科研百宝箱”之称的爱必信；
• 提供实验室服务的乐贝时；
• 生产诊断和药研使用土乳蛋白的南京优爱；
• 专做诊断和伴随诊断使用抗体的斯加特；
• 有“刘氏专家支称”的优普；
• 提供生物医药一站式供应链服务的瑞宝平台。
• 优宁维家里的品牌超过 60 家，涵盖各领域头部供应商，例如流市的冰晶标准、BD 信号通路的 CST、细胞因子 R&D 等。
• 全国有 36 个办事处，覆盖全国，可在用户身边提供服务。
• 右侧图片展示上海总部营销中心、物流中心以及研发中心。

二、课程总览

今天的课程主题主要分为以下部分：

1. 细胞培养技术发展的历程。
2. 细胞培养的基本操作流程。
3. 细胞培养过程中常见的问题及对应解决方案。

原文提到“三四个部分”，实际展开为三大部分。后续详细讲解按照“细胞准备阶段、细胞生长阶段、细胞冻存、细胞分析”等流程展开，其中分析板块内容较多，下周课再详细讲解。

三、细胞培养技术发展历程

1. 什么是细胞培养技术

细胞培养技术是将体内组织提取细胞，在体外进行培养。通过人工模拟生产环境，包括无菌条件、适宜温度、酸碱度等，并添加额外营养物质，使细胞能够在体外不断生长繁殖，并维持其基本结构和功能。

2. 发展关键节点

• 1885 年开始，科学家们不断尝试在体外进行细胞培养及移植。
• 1907 年，科学家培养的蛙神经管区长出轴突之后，组织培养才真正意义上开始。此时细胞不仅仅是被保存，而是已经开始在体外增长和繁殖。
• 1912 年，开罗将无菌操作技术引入细胞培养技术领域。同时发现添加生长因子能够使细胞生长状态越来越好，并在旋滴培养基础上进行改革创新，最终发明旋滴培养法。
• 1924 年，麦克诺创建双钙片培养法，细胞易于传代，同时减少了一些污染。

3. 培养体系更新迭代

细胞培养技术不断发展的同时，培养体系也在更新迭代：

• 1885 年，大多数使用血清或细胞来源的组织提取液进行细胞保存及培养。
• 后来，科学家研发了新的液体培养基加血清培养体系。目前科研中大多数使用的仍是这样的培养体系。
• 再后来，科学家发明减血清培养体系。原因是血清供体来源不同，例如常用的胎牛血清、新生牛血清、小牛血清，供体不同会导致血清中营养物质差别较大，可能影响整个细胞培养过程。
• 如果研究涉及抗体药研发和生产，血清影响会更大。因此后续培养体系改为不含血清的培养体系，通过添加水解物、蛋白成分以及牛血清白蛋白、球蛋白等，提供细胞生长所需营养物质。
• 最后在工业端商量生产时，直接把一些蛋白转化成多肽片段。要求更严格时，连天然蛋白都不添加，直接转化成添加重组蛋白等。这就是常说的无动物源性化学成分限定培养体系。

4. 培养基与血清分类

液体培养基

增典、增简的液体培养基主要包括常用的 BM1M、F12、L15、1640 等。

液体培养基选择依据：

• 根据购买的细胞说明书，通常会推荐最优培养体系；
• 根据实验室传统确定选择哪一种液体培养基。

血清类型对比

目前实验室常使用胎牛血清、新生牛血清和小牛血清。科研端常用胎牛血清。

血清成分复杂且不能确定，里面有很多物质，例如蛋白、生长因子、酶类、激素等。血清质量会受到产体、牛的饮殖、水源是否使用过激素以及抗生素类药物等影响。

2016 年的一篇文章提到胎牛血清里面的主要成分，并包含每一个成分的含量范围。购买胎牛血清时可参考该成分表。血清也要和细胞类型适配。细胞如何选择合适的血清，可以从购买的细胞说明书、ATCC 官网以及实验室传统中选择。

5. 血清更换批次的测试注意事项

在整个培养过程中，可能会更换血清批次，此时需要进行测试实验。注意事项包括：

• 尤其对于敏感性细胞，如原代细胞、干细胞以及免疫细胞等，更换批次时都需要重新验证血清配比。
• 血清替代要循序渐进：原血清和替代血清比例从 3:1，替换到 1:1，最后替换到 1:3。
• 有些老师在细胞状态不好时会选择添加血清浓度来提高细胞生长繁殖。但胎牛血清浓度会对细胞产生影响，高浓度血清可能改变细胞的基因表达谱。目前大多数科研中血清百分比约 10%，不建议超过这个比例。
• 要选择使用低内毒素的血清。内毒素过高会导致细胞损伤、不健康状态，例如使细胞提前进入衰老状态，引起细胞凋亡等。因此要选择品质靠谱、来源稳定的低内毒素血清。
• 血清更换的一段时间内，细胞形态以及生长速度都会产生变化，因为中间有适应过程。刚复苏的细胞不建议进行血清测试，需要等细胞达到对数生长期，生长和传代都稳定之后，再进行血清更换。

6. 血清和基础培养基对细胞生长的营养作用

血清主要提供：

• 基本营养以及结合蛋白。例如白蛋白可以携带维生素、脂肪激素等；转铁蛋白可以携带铁。
• 一些微量元素，例如硒，参加细胞的解毒代谢。
• 抗蛋白酶，可以综合保护细胞，释放的蛋白酶可用来防止蛋白酶的消化作用。
• 血清蛋白形成血清粘度，因此可以保护细胞，以免受到机械损伤。

基础培养基主要提供：

• 糖类、氨基酸、无机盐等；
• 最终起到缓冲体系的作用。

7. 应用领域与培养形式

细胞培养技术主要应用于：

• 生物医学研究中，如癌症研究、感染性疾病、疾病发生机制研究以及新药筛选。
• 生物技术领域中，如生产蛋白质、抗体和疫苗等生物制品。

科研领域中常用小的培养瓶，或用悬浮培养的锥形瓶等进行培养。免疫领域中可能使用细胞工厂、油瓶或几种培养瓶。对于单抗以及融合蛋白领域，使用的容器会更大一些。

细胞生长类型分为贴壁培养和悬浮培养。

今天讲的贴壁培养和悬浮培养，主要是在实验室中的二维培养特征。三维细胞培养需要借助 3D 水凝胶或培养支架等。3D 细胞培养相对于二维平板培养有很多优势：

• 能更好地模拟细胞在体内的生长环境；
• 如果要研究侵袭、迁移、分化等细胞活动，结构相对更准确；
• 能准确预测病程和药物反应；
• 在建立靶组织模型上有极大优势。

四、细胞培养基本操作全流程

细胞培养全流程主要分为四个方面：

1. 细胞准备阶段：信息收集，培养环境确认，判断是否符合无菌、是否具备基本细胞培养条件，确定细胞来源是直接采购还是自己制备样本。
2. 细胞生长阶段：显微镜下观察、换液、传代以及细胞计数等。
3. 细胞冻存：操作相对简单。
4. 细胞分析：细胞扩增培养达到一定要求后，对细胞进行分析，包括细胞活力检测、细胞增殖消亡周期研究；如果细胞被污染，要及时发现、及时止死。

后续内容按照横线部分详细讲解，分析板块内容较多，下周课再详细讲解。

1. 信息收集

开始培养细胞之前，要先了解自己要培养的细胞特性：

• 细胞形态：在低密度、中密度、高密度时分别是怎么样的形态。
• 增长速度：可确定后续传代频率，是一天一传还是两天一传，一传三还是一传四等。
• 生长方式：是贴壁培养还是悬浮培养。
• 培养体系：使用的培养基是 DMEM 还是 1640，是否需要在培养基中添加血清等。
• 培养环境：温度、pH、二氧化碳等。

常见大类的细胞系小环境：

• 多数人和哺乳动物细胞温度：36 到 37 摄氏度；
• pH：7.4；
• 二氧化碳：5% 到 7%。

信息来源：

• 实验室现有经验；
• 查询分数比较高的文献；
• 通过 ATCC 官网查询，输入细胞名称即可对应查询这些信息。

2. 确定细胞环境与设备耗材

要确定实验室是否具备设备，例如生物安全柜、过滤器、紫外灯、高压灭菌锅等基本仪器。

细胞培养过程中需要：

• 培养板、培养瓶、二氧化碳培养箱；
• 为细胞提供营养物质的培养基、血清；
• 添加的因子、抗生素等。

细胞检测需要大型仪器，例如流式细胞仪、酶标仪等。

冻存需要冻存液以及冻存盒等。

细胞培养过程中需要注意的事项：

• 显微镜需要定期酒精擦拭消毒。
• 开始实验之前，细胞房和生物安全柜都要进行紫外灭菌。
• 实验服、口罩、手套都要穿戴整齐，防止细胞造成不必要的污染。
• 开始操作之前，把培养液先放到 37 度培养箱中控温，减少冷刺激对细胞的伤害。
• 操作过程中不要从容器或培养板上面经过，否则很可能对细胞造成污染。
• 开始实验之前，在脑海里思考整个实验过程中需要使用的物品，一次性的都拿进操作台里，减少拿入拿出动作，保证完全无菌环境。
• 加热加液时，要做到悬空加液等操作。
• 如果有很多细胞需要传代换液，最好一次操作一株细胞，避免细胞交叉污染。交叉污染相对较难发现，做细胞鉴定成本也比较昂贵。因此一开始要严格要求自己，减少后续不必要的麻烦。
• 溶液进行灭菌分装。如果不幸污染了其中一管，其他几管也没有问题，可以继续使用。
• 培养环境方面，优宁维可以提供纯水、超纯水一体机，是一个很小的迷你纯水机，每天可以生产 15 升超纯水。

3. 细胞来源

通过国内外细胞资源库采买

采买注意事项：

• 收到货时检查瓶子是否发生破裂，培养基是否有漏液或浑浊。
• 如果实验室有条件允许，可以对细胞进行支原体检测。
• 以上三项确定无误后，迅速对细胞进行培养、扩增和冻存，以及后续实验。

实验室现有细胞复苏

实验室现有细胞只需要复苏：从液氮或从 -80 度冰箱中解冻出来之后，又重新进行培养。

复苏基本操作流程：

• 取出细胞之前，准备好所有培养基、试剂，确定培养环境，包括紫外杀菌等。
• 从液氮中取出冻存管之后，放到 37 度水浴里快速溶解。
• 原则是“慢冻快融”。慢冻指冻存时间；快融指细胞复苏时动作一定要快。
• 离心时转速低一些，时间短一点，对细胞损伤更小。
• 离心之后去上清，显微镜下观察细胞密度是否合适，进行调整，判断是否需要再分装到另一个培养瓶中培养。
• 放到培养箱中进行后续培养。
• 一般细胞复苏之后，第二天都要对细胞状态进行观察。

原代细胞样本制备

样本主要分为悬浮细胞以及实体组织材料。

• 悬浮细胞：从血液、腹水、羊水等进行分离，获得单细胞悬液。
• 实体组织材料：如肝脏、肺、皮肤等，涉及机械研磨或酶解法，也可使用美天旎组织处理器进行分离。该处理器可自己调整优化程序，重复性较高。
• 获得单细胞悬液之后，要从一堆细胞悬液中分离出目的细胞，会涉及流式细胞分选或磁珠分选等。
• 得到目的细胞之后，才能进行细胞培养、细胞分析或单细胞测序等。

4. 悬浮细胞和实体组织材料分离具体步骤

悬浮细胞分离

• 1000 转速离心 5 分钟，去上清。
• 使用 PBS 重复清洗两次。
• 使用培养基重悬，调整细胞密度。
• 离心分层，进行细胞分选。离心之后，由于各个细胞比重不同，可在分层液中形成不同的层，根据需求收集目的细胞。

实体组织材料分离

• 剪成一立方毫米的小块。
• PBS 清洗血块或毛发等。
• 通过吹打研磨、物理处理法进行分离，也可借助酶消化法分离。
• 过筛网去除大的细胞团块。
• 添加培养基重悬，显微镜下观察并调整细胞密度。

5. 组织样本处理方法

原文列举了组织样本处理方法：

• 传统组织处理方式：物理处理法，包括网托法和研磨法，主要适用于软组织。对于硬组织，处理效果可能不好。物理处理法成本较低，操作简便。
• 酶解消化法：借助胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶等。需要摸索酶的种类、浓度以及消化时间等。
• 化学处理法：主要使用 EDTA 异碳酸？原文表述为“E 地 T 异碳酸”，导致组织内化学键溶解，松动细胞间结合。化学成分影响因素较多，例如化学品类型、数量、浓度等，需要慢慢摸索优化。
• 美天旎组织处理器：有自己一套标准化流程，有优化最佳方案。处理时间快速，对组织或细胞比较温和，能节省时间和精力。可根据实验需求选择。

原文还列举了几种传统组织处理方法的比较，供有需求者截图保存。

6. 细胞分选

获得肝细胞、血液之后，需要对细胞进行细胞分选。目前常用细胞分选方法：

• 流式分选法；
• 磁珠分选法。

两种方法主要原理都是抗体抗原的特异性结合。

• 流式分选：把抗体和荧光素耦联，然后通过流式细胞仪把不同细胞进行分选。
• 磁珠分选：把抗体耦联在 50 纳米的磁珠上。在磁场作用下，如果有耦联抗体的细胞，就会停留在分选柱里面；下面没有标记的细胞就会流出。

流式分选和磁珠分选都有相关讲座，可在优宁维的小优大学堂预约学习。

7. 相关产品列举

• 做培养清洁时涉及的除菌剂等，可以去爱必信查看。
• 如果想购买原代细胞、编辑细胞等，loda 品牌也有提供。
• 细胞清洗过程中会使用到 PBS 等洗液，和爱必信产品都比较全面。
• 如果做细胞改造实验，可能使用电转移或软试剂盒。loda 有提供，并且 loda 的核转染可以提高转染效率，还能保证细胞基本活性。
• 样本制备过程中涉及细胞解离和消化，包括美天旎处理器、解离试剂盒；爱必信可提供一般细胞传代过程中所需的胰酶。
• 从血液里分离得到 PBMC 所需的分离液，以及美天旎分选磁珠等，都有相关产品。分选磁珠操作上会简单一些。
• 有想了解的产品，可以联系优宁维销售。

五、细胞生长过程：观察、换液、传代与计数

细胞生长过程中主要包括显微镜观察、换液传代以及计数等基本操作。

1. 两个基本概念

细胞粘附

细胞粘附阶段是细胞开始附着于培养皿表面的阶段，一般发生在细胞传代或复苏之后的 24 小时左右。

需要注意：原代细胞复苏之后，可能要及时更换新鲜培养基。因为 DMSO 对原代细胞伤害较大，可能导致细胞复苏之后活力下降。

细胞汇合

细胞汇合是指细胞在培养皿中附着生长的过程，指细胞覆盖培养皿的百分比。图片中大约为 60%。

了解细胞汇合度的原因：根据细胞汇合度、包括培养以及培养液颜色，综合判断细胞是否达到传代要求。

2. 显微镜观察

先肉眼观察细胞培养液颜色。现在培养基大多数添加了酚红作为指示剂，正常颜色是粉色。如果培养液呈酸性，会变成黄色，这意味着细胞已经把培养液或血清中的营养物质完全耗尽。

再静置观察细胞生长状态：

• 如果细胞状态良好，汇合度也没有达到传代要求，可以进行换液。
• 如果细胞生长状态较差，并且汇合度也较低，可能是细胞培养过程中出现问题，需要优化培养条件，排除污染情况。
• 如果细胞生长状态很好，但过于密集，汇合度基本达到 100%，就要进行细胞传代。

3. 细胞传代

传代定义：将细胞从一个培养瓶移植到新的培养瓶中，继续培养和繁殖的过程。

传代培养目的：实现细胞扩增，为后续实验做好准备。一般细胞可以传 10 到 50 代。

对于贴壁细胞，涉及胰酶消化过程。如果第一次接触一个新细胞，对细胞进行传代时，一定要在显微镜下观察胰酶消化程度。当细胞边缘开始脱落时，要及时终止。

贴壁细胞传代过程：

• 弃去培养瓶中的培养基。
• 无菌 PBS 洗或不洗，根据需求选择。如果传代之前细胞上面漂浮的细胞很多，可以洗一下；如果不多，就没有必要清洗，操作尽可能简单。
• 加入胰酶进行消化。
• 达到消化程度之后，一定要加入含有血清的完全培养基进行终止。因为血清中含有的抗蛋白酶成分可以防止蛋白酶消化。普通培养基不能终止，一定是加了血清之后才可以。
• 吹打下来之后，收集到离心管中进行离心、悬浮。
• 根据接种密度或经验，分装到其他培养瓶中。

悬浮培养相对操作更简单。吹打均匀之后，可以使细胞均匀分布在培养基中。如果不太了解，可以进行细胞计数，根据合适的接种密度分到新的培养瓶中，然后放到培养箱中进行后续培养。

4. 细胞计数

细胞计数目的：

• 了解细胞生长状况；
• 后续进行细胞功能检测时，需要接种一定数量的细胞。

一般实验室常用细胞计数板。

基础步骤：

• 使用 95% 无水乙醇擦拭计数板，在操作台上晾干。
• 取一张干净的盖玻片覆盖计数板。
• 滴加混匀的细胞悬液。
• 在显微镜下计数。

计数注意事项：

• 对于成团的细胞，是记作一个还是数清楚或重新吹，按自己的习惯即可。如果记作一个，后续就只记一个。
• 如果视野里的细胞数目相差比较大，需要重新吹匀计数。
• 细胞悬液密度计算：观察到的四个视野里的平均数，乘以 10 的 4 次方，就是细胞悬液的密度。
• 计数规则：记上不计下，记左不计右。
• 细胞悬液吹匀之后应该立即计数，防止细胞降解导致细胞计数不准确。

相关产品：

• DMEM、1640、F12：爱必信有相关产品。
• 龙子？原文“龙子”对于免疫细胞有专门的特殊培养基 x vio 系列。
• biotechni 可提供细胞培养过程中的细胞因子或小分子化合物。
• 爱必信可提供双抗青霉素、链霉素等。
• 血清和替代物、培养耗材等，公司也可以提供。

六、细胞冻存

细胞冻存是指将细胞放在低温环境中，达到减少细胞代谢的作用，从而对细胞进行长期储存和保种，供后续实验和临床使用。

基本步骤：

• 贴壁细胞需要添加胰酶进行消化。
• 完全培养基终止之后，收集到 15 毫升离心管里。悬浮细胞可以直接收集进行离心。
• 去除上清之后，添加冻存液进行重悬。
• 如果冻存的细胞数量比较多，可以分到几个冻存管里。
• 短期冻存可以放到 -80 度冰箱。
• 长期冻存还是建议放到液氮里面进行冻存。
• 降温程序可以通过人工传统降温法，也可以借助冻存盒等工具。

小 tips：

• 对于一些特殊细胞，例如原代皮肤细胞，会额外添加表面保护剂，例如海藻糖，可以提高细胞存活率。
• DMSO 对大部分细胞没有毒性，所以可以使用 DMSO 对细胞进行冷冻保存。如果有些细胞对 DMSO 敏感、有毒，也可以使用甘油进行保存。
• 冻存时一定要做好标记，标记好细胞名称、时间、冻存位置以及培养基等，方便后续查询。

爱必信可提供 DMSO、无 DMSO 无血清细胞冻存液以及细胞冻存液等。原文还提到紫天平、电视记、格丽斯等产品，信息不够清晰。

七、细胞培养常见问题与解决方案

1. 如何选用细胞培养基

• 优先根据细胞来源公司提供的培养条件。
• 其次可以参考 ATCC 推荐的细胞对应培养基来选择。
• 不要骤然更换培养基。如果更换后的培养基与原先供应的培养条件不同，可能对细胞形态造成影响，导致细胞死亡无法存活，或者细胞表型、功能缺失。

2. 培养基使用一段时间后颜色偏紫

原因：培养基如果多次开罐，会使培养液中的二氧化碳逐渐溢出，最终造成培养基越来越偏碱性，从而使颜色偏紫。尤其在剩余培养基越少的时候，颜色越紫。

对应操作：可以将培养瓶瓶盖轻轻旋松一些，然后放入二氧化碳培养箱中校正溶液 pH 值。过一段时间颜色会恢复正常。变紫的培养基其实也可以继续使用，培养细胞时在培养箱中会自动恢复颜色，不用担心。

3. 什么培养基可以省去添加酚红

酚红在培养基中被用来做 pH 指示器：中性时是红色，酸性时是黄色，碱性时是紫色。

为了避免库存类反应？原文表述为“库存类的反应”，培养细胞尤其是针对哺乳类细胞时，可以不用添加酚红的培养基，因为酚红会干扰检测。研究人员在做流式细胞检测时，也不使用添加酚红的培养基。

4. 细胞何时换液最佳

• 细胞消化传代之后，建议隔天或隔两天换一次培养液。
• 细胞传代之后，如果发现细胞碎片增多、细胞死亡较多，在细胞形态已经形成的前提下，可以第二天换液。
• 对于生长速度较慢的细胞，可以放点培养基，减少换液次数，主要使细胞静养。
• 细胞传代之后，如果导致细胞分布不均、细胞间隙大、局部密度大、细胞堆叠，这种情况也可以不换液，可以采取消化重铺的方式。

5. 如何控制胰酶消化时间

胰酶消化是细胞培养中非常关键的步骤。

• 消化过度：细胞碎片会增多，细胞成片脱落，严重影响细胞活性。
• 消化不足：细胞贴壁难以脱落，反复吹打同样会损伤细胞活性。

具体消化时间需要观察：观察到细胞边缘收缩、细胞间隙变大，轻轻摇动培养瓶，能够看到细胞呈流沙状态之后，就可以终止消化。

6. 对细胞形态有疑问如何处理

• 确定细胞所使用的培养基种类是否是说明书建议的。如果改变了培养基种类，细胞形态也可能发生变化。
• 以购买公司官网的照片为准，可以参考 ATCC 网站。
• 如果上皮型细胞明显变成纤维型细胞，或者纤维型细胞明显变成上皮型细胞，需要查看细胞是否提供了 STR 检测报告，确定细胞身份是否正确。
• 了解细胞的传代次数是否过高，导致细胞分化变异。
• 细胞是否经过加药诱导、是否经过转染，都会引起形态变化。
• 细胞低密度和高密度时形态也不一样。有些细胞形态比较慢，要 1 到 2 天才能展开。这样的细胞正常形态要等细胞密度起来之后才能确定。

八、社群、工具与服务

• 可以加入学习社群：扫描小助理微信，加入优宁维官方互助社群。群中可以抢先知道精彩课程，分享实验小点子，还有很多专家在线回答疑问。扫描左方二维码加入学习社群。
• 如果想获取更多产品信息，可以登录优宁维在线商场，搜索想要的产品，也可以关注小程序，随时使用，方便快捷。
• 优宁维三大科研工具：

1. 小优大学堂：让科研不再难。
2. 优博士学术中心：有很多实验干货、操作视频、技术文章等。
3. 优多多促销中心：让用户天天逛日日省，可以在促销中心选择需要的产品，非常实惠。

• 如果想查阅标准的技术支持和文献，可以进入学术中心。进入官方网页后，在解决方案中直接搜索细胞、细胞培养，就可以找到所有相关视频讲解，里面有很多干货文章。优宁维抗体专家公众号和优宁维在线商场都有入口可以进入。
• 如果想了解更多的讲座主题，可以扫码预约小优大学堂。每周都有不同课程，可以随时挑选感兴趣的课程学习。
• 促销中心可以查到很多有折扣的商品，非常划算，也有各式各样的礼品赠送给用户，欢迎选购所需产品。

九、关键操作清单（按原文整理）

• 培养前先确认细胞特性：形态、增长速度、贴壁或悬浮、培养基、血清、温度、pH、CO2。
• 培养环境要具备：生物安全柜、过滤器、紫外灯、高压灭菌锅、CO2 培养箱等。
• 实验前：细胞房和生物安全柜紫外灭菌；实验服、口罩、手套穿戴整齐；培养液 37 度预温；所需物品一次性拿入操作台。
• 操作中：悬空加液；不要从容器或培养板上方经过；一次操作一株细胞，避免交叉污染；溶液灭菌分装。
• 采购细胞到货：检查瓶破、漏液、浑浊；条件允许做支原体检测；无误后迅速培养、扩增、冻存。
• 复苏：慢冻快融；37 度水浴快速溶解；离心转速低、时间短；第二天观察细胞状态。
• 原代细胞复苏后：及时更换新鲜培养基，减少 DMSO 伤害。
• 贴壁传代：弃培养基；PBS 洗或不洗；胰酶消化；显微镜观察至细胞边缘开始脱落；加含血清完全培养基终止；离心悬浮；分装。
• 悬浮传代：吹打均匀；必要时细胞计数；按接种密度分装。
• 计数：95% 无水乙醇擦拭计数板；盖玻片覆盖；滴加混匀悬液；记上不计下、记左不计右；四视野平均数 × 10^4；吹匀后立即计数。
• 冻存：贴壁细胞胰酶消化并终止；收集离心；去上清；加冻存液重悬；分装冻存管；短期 -80 度，长期液氮；标记名称、时间、位置、培养基。
• 换液：传代后隔天或隔两天换液；碎片多、死亡多可第二天换液；生长慢可减少换液；分布不均可消化重铺。
• 胰酶消化：以细胞边缘收缩、间隙变大、摇动呈流沙状态为终止依据。

十、原文不清晰或待确认信息

以下内容在原文中表述不清或存在前后写法不一致，笔记按原讲述保留，未作外部补充：

• 公司名称有“上海优牛维”“优尼维”“优宁维”“用牛为”“雍牛维”等多种写法。
• 子品牌名称有“诺贝时”“乐贝时”等不同写法。
• 液体培养基“BM1M”原文如此，可能为某种培养基缩写，但未进一步说明。
• 血清“麻血清”原文如此，可能指某种特殊血清，但未展开。
• 化学处理法中“E 地 T 异碳酸”原文如此，具体试剂名称不清晰。
• 细胞类型“thp 外细胞”原文如此，具体细胞名称未明确。
• 冻存产品部分“紫天平”“电视记”“格丽斯”等原文表述不清晰。
• 三维培养仅简要提到 3D 水凝胶、培养支架及优势，未展开具体操作。
• 细胞分析板块明确说下周课再详细讲解，本次未展开。