多角度光散射检测器：原理与应用

Wyatt × Waters

多角度光散射检测器
原理与应用

自1982年起，用绝对光散射方法重新定义高分子表征

01✦导读

1982

Philip Wyatt 发明首台多角度光散射仪

41,000+

同行评审英文论文引用 Wyatt 数据

200 Da~10⁹ Da

分子量测量范围（绝对方法）

2023

正式加入 Waters 集团

光散射技术是公认的聚合物绝对分子量测定方法（1999 年起），在天然状态下非破坏性测量，覆盖蛋白质、核酸、脂质纳米粒、病毒等广阔样品范围。

02◈核心技术原理

☀️光的散射

天空呈蓝色、晚霞呈红黄色，都是自然光在空气中发生散射的结果。在实验室中，以激光照射样品溶液，经激光极化产生电磁波散射光，散射光强度与物质分子量和尺寸直接相关。

光散射测量三参量：分子量 Mw / 均方根半径 Rg / 第二维里系数 A₂

📏均方根半径 Rg

将高分子链按链段切开，以质量加权计算链段到质心的距离平方，即得均方根半径。Rg 与质量分布相关，区别于动态光散射所测的流体力学半径 Rh。线性分子和球形分子即使扩散系数相同，Rg 也会不同，因此可用 Rg 判定溶液中高分子构象。

Rg² = Σ mᵢrᵢ² / Σ mᵢ

⚙️第二维里系数 A₂

A₂ 反映样品溶解度。蛋白质药物中，A₂ 用于预测长期稳定性；高分子中，A₂ 区分良溶剂/非良溶剂体系，非良溶剂下高分子终会析出，体系不稳定。

🔬角度函数与构象判断

以 660 nm 检测波长，尺寸小于约 10 nm 时，样品表现为各向同性散射，各角度光强相同，无法测 Rg，但仍可准确测量分子量；尺寸更大时，各向异性散射，可通过角度函数获得 Rg。

尺寸小于 10 nm 时，可搭配在线 DLS 或粘度检测器测量 Rh。

03🖥技术平台与产品

🔹动态光散射 DLS

比色杯式 DLS：支持 2 µL 石英杯、4 µL 塑料杯及常规比色杯；测定粒径、电位与有效电荷。亦提供微孔板高通量动态光散射，兼容 96/384/1536 孔板，用于高通量筛选与样品扫测。

🔹静态光散射 MALS（即 DAWN）

最新型号 DAWN：18 角度激光光散射，测量分子量 200 Da ~ 10⁹ Da，尺寸 10 nm ~ 500 nm（特殊结构可达 1000 nm）。功率 120 mW，为市售功率最高的多角度光散射仪，灵敏度世界领先。

🔹SEC/GPC × MALS 联用

将 MALS 接入 SEC/GPC 系统（即 SEC-MALS / GPC-MALS），由色谱柱按尺寸分离，MALS 直接检测分子量与尺寸，不需要标样假设。超高分子量样品（病毒、LNPs、外泌体）可换用场流分离（FFF）× MALS，与 SEC-MALS 互为交叉验证。

💡仪器智能状态指示

检测池上方配有超声清洗装置；系统提供蒸气压力报警、漏液传感器等安全装置。面板以红/黄/绿三色指示系统状态（绿=平衡良好，黄=未平衡，红=未冲洗好）。

04↗SEC-MALS 工作流

系统配置

色谱泵 → 进样器 → 色谱柱（SEC/GFC）→ 紫外检测器 + MALS 光散射检测器 + 示差折光检测器（dRI）→（可选粘度检测器）。

泵→ 进样器→ SEC柱→ UV→ MALS→ dRI

数据处理逻辑

UV 或 dRI 信号：结合消光系数/dn/dc 计算浓度。MALS 的散射信号：由 Rayleigh 方程得到每个保留时间切片上的分子量。两者结合即可得到分子量分布曲线与 PDI。

M = f (散射强度, dn/dc, 浓度)

计算过程全程无需标样校正，为绝对测量。

05⚠传统相对分子量标定的局限

标样与样品结构不一致——同样的保留时间可能对应不同分子量。例：木球与铁球尺寸相同，gpc 保留时间相同，但分子量差异大。
分子量超过标样覆盖范围——实际样品高分子量端超出标曲上端，导致测得的分子量偏低。例：实际样品分子量高于市售最高标品（140 万），无法准确外推。
样品结构随分子量变化——Mark-Houwink 方程中 α 值并非恒定。从几千到 20 万分子量段 α 恒定，但高于 20 万后 α 发生变化，结构由棒状→线团→密堆积演化，单一 α 不成立。
非理想色谱行为——吸附、静电、二次排阻等会使保留时间偏移。相同分子量和尺寸的样品，可能因潜在吸附而延后出峰。

结论：传统标定方法（窄标校正/普式校正）依赖标品与样品结构相似，在高分子量、宽分布或共聚物体系中系统性失准。MALS 直接测量，从原理上避免了以上陷阱。

06★关键应用案例

🧬

蛋白质寡聚状态验证

不同浓度进样，SEC-MALS 分子量均为 120K；理论单体约 24K，比值 5 倍，确认为稳定的五聚体。浓度不影响寡聚状态，证明样品结构稳定。

120K ÷ 24K = 5 → 五聚体

💊

生物类似药一致性评价

原研药与类似药的 SEC-MALS 图谱叠加，分子量分布重叠度高即判定相似。也可结合 UV 定义的聚集体比例：若类似药多聚体峰面积更低，则其聚体控制更优。

分子量分布相似 + UV 聚体占比 = 综合比较

🛡️

单抗聚集体的真实身份

UV 几乎看不到的聚集峰，MALS 显示分子量高达百万（可溶性聚集体/颗粒）；单体 150K 的抗体，其理论二聚体 300K。实测 188K 处并非二聚体，真正的二聚体位于 300K。仅凭保留时间不足以作结论。

SEC-UV 所见未必为真，需分子量证据

🍬

糖蛋白 / 高糖基化蛋白

高糖基化蛋白（如 HIV 表面蛋白）用质谱难以表征，MALS 可在非破坏条件下分离蛋白与糖的分子量贡献。假设糖理论分子量 10K，实测总糖修饰 30K，则蛋白结合了 3 条糖链。

总分子量 = 蛋白 + 糖 → 推算糖链数量

🧫

多肽寡聚体分析

多肽在制剂条件下通过非共价作用形成寡聚体，质谱会打断相互作用。SEC-MALS 实测分子量 26K，单体 3.7K，比值≈7，判断为均一七聚体体系。

26K ÷ 3.7K ≈ 7 → 七聚体

🦠

AAV 空壳率 / 实心率

SEC-MALS 同时测量空心与实心 AAV 的分子量和粒径，可计算基因组滴度、物理滴度并推算出实心率。数据稳健、精密度高，可作为早期研发与 QC 放行方法，已发表与 AUC 高度一致的验证结果。

实心率 = 基因组滴度 ÷ 物理滴度

🧵

mRNA 天然构象表征

mRNA 为线状分子，在溶液中呈环状/线团/折叠等多种构象，不能用球状蛋白标品校正。SEC-MALS 中 mRNA 分子量虽高，但 Rg 显著大于分子量相近的球状蛋白，直接证明其线状舒展结构。

分子量与尺寸双维度评价 mRNA 均一性

📦

LNP 中核酸装载比例分布

SEC-MALS 在线分离不同粒径 LNP，同步获取核酸比例。结合馏分收集器离线验证，两者结果一致。进一步通过 RNA 表观分子量与理论值之比，可推算每个 LNP 中 RNA 链数（如 1000K 理论值/ 2000K 实测 = 2 条链）。

不同粒径 LNP 的 RNA 装载比例 → 工艺优化

⛰️

超宽分子量样品（铁蛋白等）

分子量从几十万跨越至上亿（如铁蛋白），几乎所有相对方法均失效。SEC-MALS 可覆盖超宽分子量分布：前段散射强但浓度低（分子量大），后段浓度高但分子量低，准确捕捉高聚端信息。

几乎只有绝对方法可解决 → MALS 优选

"我们的分子量是直接测量的，没有假设。"

—— 多角度光散射检测器核心价值

07◆核心优势总结

✅ 绝对分子量测量

无需标样，直接测定 200 Da 至 10⁹ Da 分子量，彻底摆脱相对标定的系统性偏差。

✅ 天然非破坏

在溶液天然状态下直接测量，不打断非共价相互作用，真实反映寡聚/聚集/构象。

✅ 多维表征

同时获取 Mw、Mn、Mz、PDI、Rg、A₂、构象信息（球/线团/棒）、糖修饰、装配数。

✅ 宽谱适用性

适用蛋白质、核酸、多肽、病毒、LNPs、聚合物、超高分子量样品等，带电或不带电均可。

      总结：多角度光散射检测器（MALS）以绝对、非破坏、多维度的测量方式，正在成为高分子、生物药、疫苗、核酸药物与纳米颗粒表征的“金标准”技术。Wyatt 用 40+ 年持续迭代，与 SEC/GPC/FFF 联用，从科研走向 QC 放行，是诠释样品真实状态的可靠工具。
    

多角度光散射检测器原理与应用